Львівський національний медичний університет імені данила галицького кафедра біологічної хімії методичні вказівки для практичних занять з біологічної хімії (для студентів стоматологічного факультету) - страница 12

^ Практична робота
Дослід 1. Колоїдна проба Вельтмана на визначення стану білків крові.

Принцип методу. Реакція ґрунтується на флокуляції білків у сироватці крові, яку нагрівають до однократного закипання після додавання її до розчину певної (залежить від колоїдної стабільності системи) кількості кальцію хлориду.

^ Матеріальне забезпечення: пробірки, 0,5 % розчин кальцію хлориду, сироватка крові.

Хід роботи. До 4,9 мл дистильованої води додають 0,1 мл сироватки крові, вміст пробірки перемішують шляхом її перевертання і потім доливають 0,1 мл 0,5 % розчину хлориду кальцію. Вміст пробірки струшують і нагрівають над газовим пальником до закипання суміші. Потім пробірку охолоджують і дивляться крізь неї на світло.

Якщо пластівці в пробірці не з’являються, то до розчину додають ще 0,1 мл СаСl2 і знову нагрівають до кипіння. Процедуру повторюють до випадання осаду в формі пластівців.

Результати оцінюють за загальною кількістю кальцію хлориду в цій реакції. Норма становить 0,4 – 0,5 мл кальцію хлориду.

^ Клініко-діагностичне значення. Пробу Вельтмана використовують для ранньої діагностики захворювань печінки, ревматизму, туберкульозу легенів та інших захворювань, які супроводжуються диспротеїнеміями, переважанням грубодисперсних глобулінових фракцій.


Дослід 2. Фракціонування білків плазми крові методом висолювання: визначення альбумінів і глобулінів плазми крові.

Принцип методу. Білки можна виділити з розчинів у вигляді осадів. Осадження білків концентрованими розчинами нейтральних солей (амонію сульфату, натрію хлориду тощо) називають висолюванням. Більшість реакцій висолювання, а також реакції зі спиртом, ацетоном є зворотними.

Якщо до розчинів білків додавати солі лужних і лужноземельних металів, то їх іони адсорбуються молекулами білків, знімають з них електричні заряди і перетворюють їх на електронейтральні. Надалі колоїдні частки укрупнюються, що зумовлює утворення осаду. Реакцію висолювання зумовлює дегідратація молекул білка з одночасною нейтралізацією електричних зарядів. Процес висолювання білків є зворотною реакцією, оскільки осад білка можна знову розчинити шляхом розведення його водою або зменшення концентрації солей діалізом. Для висолювання білків потрібна різна концентрація солей. Це дає змогу отримати різні білкові фракції.

Білки осаджують за різних концентрацій солей. Деякі з них вже випадають в осад за концентрації амонію сульфату приблизно до 1/10 від насичення, глобуліни– за напівнасичення, альбуміни – за повного насичення.

^ Матеріальне забезпечення: сироватка крові, амонію сульфат, лійки, фільтри.

Хід роботи. У пробірку вливають 2 – 3 мл сироватки крові, додають рівний об’єм насиченого розчину амонію сульфату, перемішують. В осад випадають глобуліни (50 % насичення розчину), які мають відносно велику молекулярну масу і невеликий заряд. Осад відфільтровують. До осаду на фільтрі додають невелику кількість води, в отриманому розчині містяться глобуліни, наявність яких виявляють шляхом кип’ятіння, спостерігають утворення осаду. Фільтрат з розчином альбумінів розливають у дві пробірки.

У першу пробірку додають кристалічний амоній сульфат до повного насичення (100 % насичення розчину). В осад випадають альбуміни. Вміст другої пробірки кип’ятять, спостерігають утворення осаду альбумінів.


Фракційне розділення білків сироватки крові


Назва білка

Використана сіль

Ступінь насичення

Утворення осаду

Глобуліни










Альбуміни












Пояснити отримані результати.

^ Клініко-діагностичне значення. Осадження білків застосовується при виділенні їх з тканин, розділенні суміші білків, для виявлення у різних біологічних рідинах. Методом висолювання виділяють три фракції білків плазми крові: альбуміни, глобуліни, фібриноген.

Реакції осадження білків мають важливе значення в практиці. Їх застосовують для вивчення властивостей білків, виділення білків із розчинів, виявлення наявності білків у сечі (при нефриті, серцевій декомпенсації тощо).


Дослід 3. Визначення залишкового азоту крові (метод Боданського).

Принцип методу. Залишковий азот крові визначають у безбілковому фільтраті після осадження білків крові; безбілковий фільтрат мінералізують концентрованою сульфатною кислотою. При цьому азот всіх азотовмісних сполук у вигляді аміаку зв’язується з сульфатною кислотою і утворює амонію сульфат, який з реактивом Несслера утворює сполуку жовто-оранжевого кольору. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації азоту.

^ Матеріальне забезпечення: кров, 10 % розчин трихлорацетатної кислоти, сульфатна кислота концентрована, гідрогену пероксид концентрований, 12,5 М розчин натрію гідроксиду, реактив Несслера, стандартний розчин (1 мл розчину амонію сульфату містить 0,05 мг азоту), лакмусовий папір, мікропіпетки, ФЕК, термостійкі пробірки.

^ Хід роботи.

1. Отримання безбілкового фільтрату: у центрифужну пробірку наливають 2,8 мл 10 % розчину трихлорацетатної кислоти і 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують, залишають на 15 хв і центрифугують.

2. Мінералізація: у пробірку з тугоплавкого скла вносять 0,5 мл центрифугату, добавляють 0,05 мл концентрованої сульфатної кислоти. Спалювання здійснюють на пісочній бані. При спалюванні пробірка повинна торкатися тільки верхнього шару піску. Спочатку випаровується вода – досліджувана рідина буріє. Пробірку знімають з бані, дають їй охолонути, добавляють у пробірку 2 краплі гідрогену пероксиду концентрованого і знову ставлять для спалювання до знебарвлювання рідини. Слід перевірити колір рідини у пробірці після її охолодження, оскільки часто рідина, яка здається безбарвною у гарячому стані, при охолодженні темнішає.

Після охолодження в пробірку додають 10 мл свіжокип’яченої дистильованої води і нейтралізують 12,5 М розчином натрію гідроксиду до слаболужної реакції. Реакція визначається за зміною кольору лакмусового папірця з червоного на синій. Надлишок лугу при нейтралізації призводить до помутніння розчину. Нестача лугу викликає випадання солей меркурію з реактиву Несcлера і дослід вважають зіпсованим.

^ 3. Кольорова реакція (несслеризація): у пробірку добавляють 0,5 мл реактиву Несслера (К2HgІ4), внаслідок чого вміст пробірки забарвлюється у жовтий колір різної інтенсивності залежно від вмісту азоту:



Одночасно з дослідною пробою опрацьовують стандартну пробу: 0,2 мл стандартного розчину, 0,05 мл концентрованої сульфатної кислоти, 0,3 мл 12,5 М натрію гідроксиду, 0,5 мл реактиву Несслера і 9,8 мл дистильованої води. Дослідну і стандартну проби спектрофотометрують порівняно з контролем на реактиви при довжині хвилі 440 – 450 нм (фіолетовий світлофільтр) у кюветі товщиною 0,5 см.

Контроль ставлять як стандартні проби, але замість стандартного розчину амонію сульфату добавляють воду. Контрольні проби повинні мати легкий жовтуватий відтінок. Більш насичений колір контролю свідчить про наявність у дистильованій воді азоту (аміаку).

Розрахунок проводять за формулою:

Cд = Сст × (Ад/Аст ) = 21,42 ×(Ад/Аст),

де: Сд – концентрація залишкового азоту в досліді, ммоль/л;

Ад – оптична густина дослідної проби;

Сст – концентрація залишкового азоту в стандарті (Сст = 21,4 ммоль/л);

Аст – оптична густина стандартної проби.

Коефіцієнт перерахунку у ммоль/л – 0,714.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

^ Клініко-діагностичне значення. Вміст залишкового азоту в крові становить 14,3 – 25 ммоль/л (20 – 35 мг %). Визначення небілкового азоту і його окремих компонентів проводять з метою діагностики порушень видільної функції нирок та оцінки ступеня ниркової недостатності; оцінки сечовиноутворювальної функції печінки і виявлення печінкової недостатності; оцінки кількісних змін середніх молекул, які накопичуються в організмі при різних захворюваннях, що супроводжуються ендогенними інтоксикаціями.

Для початкових стадій деяких захворювань характерно не стільки підвищення рівня залишкового азоту крові взагалі, скільки зміна кількісного вмісту компонентів залишкового азоту, співвідношення між ними та загальним азотом.

Підвищення рівня небілкового азоту в крові називають азотемією. Азотемія може бути двох видів: абсолютною (нагромадження в крові компонентів залишкового азоту) і відносною (дегідратація організму, наприклад, при блювоті, проносі). В залежності від причин, які викликають захворювання, абсолютна азотемія поділяється на ретенційну і продукційну. Ретенційна азотемія наступає в результаті недостатнього виділення з сечею азотовмісних продуктів при нормальному поступленні їх в кров’яне русло. Ретенційна (ниркова) азотемія зустрічається при гломерулонефритах, пієлонефриті, туберкульозі та амілоїдозі нирок. Позаниркові ретенційні азотемії зумовлені порушенням гемодинаміки і, відповідно, зниженням клубочкової фільтрації. Вони виникають у результаті серцево-судинної декомпенсації, при локальному порушенні кровообігу в ниркових артеріях. Продукційна азотемія виникає при збільшеному поступленні азотовмісних продуктів в кров, як наслідок посиленого розпаду тканинних білків. Функція нирок при цьому не порушена. Продукційна азотемія спостерігається при кахексії, лейкозах, новоутвореннях, кишковій непрохідності, лікуванні глюкокортикоїдами. Азотемія зустрічається у недоношених дітей.

Зменшення вмісту залишкового азоту спостерігається при недостатньому харчуванні, зокрема білковому, тяжкій печінковій недостатності, некрозі печінки, іноді при вагітності.


^ Контроль виконання лабораторної роботи

1. При аналізі крові хворого визначені залишковий азот і сечовина. Частка сечовини в залишковому азоті значно зменшена. Для захворювання якого органа характерний даний аналіз?

А. Нирки

В. Серце

С. Кишка

D. Печінка

Е. Шлунок

2. У хворого на гломерулонефрит спостерігається азотемія. На яку речовину припадає найбільше азоту?

А. Креатинін

В. Амінокислоти

С. Сечова кислота

D. Сечовина

Е. Амонійні солі

3. Вміст альбумінів у плазмі крові – 15 г/л. Як називається такий стан та які його наслідки для організму?


4. У хворих з постійною протеїнурією можуть з’явитися набряки. Пояснити причину такого стану.
5. Як за вмістом залишкового азоту крові та загального азоту сечі диференціювати ретенційну і продукційну азотемії?

^ Приклади тестів „Крок-1”

1. У пацієнта вміст загального білка в плазмі крові в межах норми. Які серед наведених показників вірогідні для цього випадку?

А. 35 – 45 г/л

В. 50 – 60 г/л

С. 55 – 70 г/л

D. 65 – 85 г/л

Е. 85 – 95 г/л

2. При дослідженні крові хворого виявлено значне збільшення активності МВ-форми КФК (креатинфосфокінази) та ЛДГ1. Яка патологія найбільш імовірна?

А. Ревматизм

В. Інфаркт міокарда

С. Холецистит

D. Панкреатит

Е. Гепатит

3. У хворого діагностовано хворобу Вільсона-Коновалова, за якої спостерігається виділення іонізованої міді з сечею, відкладання її в органах і тканинах. Порушення синтезу якого білка плазми крові є найбільш вірогідною причиною цього захворювання?

А. Трансферину

В. Гаптоглобіну

С. Церулоплазміну

D. Пропердину

Е. Кріоглобуліну

4. Для транспортування СО2 із тканин до легенів необхідна участь ферменту:

А. Декарбоксилази

В. Карбоангідрази

С. Карбоксилази

D. Каталази

Е Цитохромоксидази

5. Людина тривалий час перебувала в умовах високогір’я. Які зміни в її крові будуть спостерігатися?

А. Збільшення кількості лейкоцитів

В. Зменшення кількості лейкоцитів

С. Збільшення спорідненості гемоглобіну до кисню


D. Зменшення частоти пульсу

Е. Зменшення спорідненості гемоглобіну до кисню


Індивідуальна самостійна робота студентів

  1. Оцінка показників азотистого обміну та зміни вмісту азотовмісних небілкових компонентів крові


Література

Основна:

  1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

  2. Гонський Я. І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

  3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

  4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

  5. Клінічна біохімія. / За ред. проф. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2004. – 295 с.

  6. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – 297 с.

Додаткова:

  1. Ангельські С., Якубовскі З., Домінічак М.Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

  2. Бышевский А.Ш.,Терсенов О. А. Биохимия для врача. Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – 384 с.

  3. Бишевський А.Ш., Терсенов О.А., Біохімія для лікаря. – Київ, Укр. центр духовної культури, 2001. – 395 с.

  4. Камышников В.С. Клинические лабораторные тесты от А до Я и их диагностические профили / МЕДпрессинформ – Москва, 2005. – 320 с.


Тема № 10. Дослідження згортальної, антизгортальної та фібринолітичної систем крові. Біохімічні закономірності реалізації імунних процесів.

Мета заняття. Знати роль компонентів згортальної, антизгортальної та фібринолітичної систем в підтриманні агрегатного стану крові. Давати характеристику біохімічним компонентам імунної системи, знати біохімічні механізми виникнення імунодефіцитних станів.

^ Актуальність теми. Згортання крові є складним фізіологічно-біохімічним процесом, захисною реакцією організму на крововтрату. Знання біохімічної характеристики згортальної, антизгортальної та фібринолітичної систем крові є необхідними для розуміння механізмів підтримання агрегатного стану крові за умов норми та при численних захворюваннях (у тому числі зубо-щелепної системи), а також для їх своєчасної корекції фармпрепаратами.

^ Конкретні завдання.

8161972833547917.html
8162134227907134.html
8162223381694675.html
8162284478723456.html
8162376932394291.html